PCR實驗小技巧之組織mRNA提取
更新時間：2016-02-17 點擊次數(shù)：1062次一、材料
水稻葉片或小鼠肝組織。
二、設(shè)備
研缽，冷凍臺式高速離心機，低溫冰箱，冷凍真空干燥器，紫外檢測儀，電泳儀，電泳槽。
三、試劑
1、無RNA酶滅菌水：用將高溫烘烤的玻璃瓶（180℃ 2小時）裝蒸餾水，然后加入0.01%的DEPC（體積/體積），處理過夜后高壓滅菌。
2、75%乙醇：用DEPC處理水配制75%乙醇，（用高溫滅菌器皿配制），然后裝入高溫烘烤的玻璃瓶中，存放于低溫冰箱。
3、1×層析柱加樣緩沖液；20mmol/L Tris·Cl(pH7.6)，0.5mol/L NaCl，1mmol/L EDTA(pH8.0)，0.1% SDS。
4、洗脫緩沖液：10mmol/L Tris·Cl (pH7.6)，1mmol/L EDTA (pH8.0)，0.05% SDS。
四、操作步驟
（一）動植物總RNA提取-Trizol法
Trizol法適用于人類、動物、植物、微生物的組織或培養(yǎng)細菌，樣品量從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA*蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑點分析，斑點雜交，Poly(A)+分離，體外翻譯，RNase封阻分析和分子克隆。
1、將組織在液N中磨成粉末后，再以50-100mg組織加入1ml Trizol液研磨，注意樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%。
2、研磨液室溫放置5分鐘，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒。
3、取上層水相于一新的離心管，按每mlTrizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鐘，12000g離心10分鐘。
4、棄去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，渦旋混勻，4℃下7500g離心5分鐘。
5、小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10分鐘，注意不要干燥過分，否則會降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中，必要時可55℃-60℃水溶 10分鐘。RNA可進行mRNA分離，或貯存于70%乙醇并保存于-70℃。
[注意] 1、整個操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。
2、加氯仿前的勻漿液可在-70℃保存一個月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。
（二）mRNA提取
由于mRNA末端含有多poly(A)+，當總RNA流徑oligo(dT)纖維素時，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素柱上，在低鹽濃度或蒸餾水中，mRNA可被洗下，經(jīng)過兩次oligo(dT) 纖維素柱，可得到較純的mRNA。
1、用0.1mol/L NaOH懸浮0.5-1.0g oligo(dT)纖維素。
2、將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱中或裝入填有經(jīng)DEPC處理并經(jīng)高壓滅菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床體積為0.5-1.0ml，用3倍柱床體積的滅菌水沖洗柱床。
3、用1x柱層析加樣緩沖液沖洗柱床，直到流出液的pH值小于8.0。
4、將（一）中提取的RNA液于65℃溫育5分鐘后迅速冷卻至室溫，加入等體積2x柱層析緩沖液，上樣，立即用滅菌試管收集洗出液，當所有RNA溶液進入柱床后，加入1倍柱床體積的1x層析柱加樣溶液。
5、測定每一管的OD260，當洗出液中OD為0時，加入2-3倍柱床體積的滅菌洗脫緩沖液，以1/3至1/2柱床體積分管收集洗脫液。
6、測定OD260，合并含有RNA的洗脫組分。
7、加入1/10體積的3M NaAc(pH5.2)，2.5倍體積的冰冷乙醇，混勻，-20℃30分鐘。
8、4℃下12000g離心15分鐘，小心棄去上清液，用70%乙醇洗 滌沉淀，4℃下12000g離心5分鐘。
9、小心棄去上清液，沉淀空氣干燥10分鐘，或真空干燥10分鐘。
10、用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并貯存于-70℃）。
[注意] 1、mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。
2、oligo(dT)纖維素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗凈，然后用層析柱加樣緩沖液平衡，并加入0.02%疊氮鈉（NaN3)冰箱保存，重復使用。每次用前需用NaOH水層析柱加樣緩沖液依次淋洗柱床。
