信帆生物：單細胞表觀遺傳學研究指南
更新時間：2016-04-28 點擊次數：1170次生物通報道 ：隨著測序成本的直線下降，解讀一個生物的基因組正在逐漸成為研究者們的日常工作。然而，并不是所有細胞都能夠達到測序要求，測序一般需要幾千到一百萬細胞。舉例來說，如果你研究的是早期胚胎發育，那么可用的細胞數量就很少，在這種情況下每一個細胞都很寶貴。
The Scientistzui近撰文詳細介紹了單細胞表觀遺傳學研究中的一些關鍵技術。這些技術可以幫助我們在單個細胞中檢測DNA、組蛋白和染色質水平上的表觀遺傳學修飾。
染色質水平的改變
高等生物的細胞核負責儲存基因組DNA，這些DNA環繞著由四種組蛋白組成的八聚體，形成碟狀的核小體結構。基因組DNA以這樣的形式包裝成為染色質，使DNA受到良好的保護。
所有控制基因轉錄的調控蛋白，都要結合在DNA上起作用。而染色質的3D結構會隨著細胞生活周期而變化，調節調控因子所能接觸到的基因。
人們一般使用染色質構象捕獲技術，在細胞群體中研究染色質水平上的改變。但這種技術只能給出平均的3D結構，“你無法了解單細胞的染色質結構，”劍橋大學的Ernest Laue教授說。Laue教授之前參與的一項研究就解決了這個問題，找到了在單細胞中對染色質彎曲和折疊進行定量的方法。這個方法主要是Babraham 研究所的Takashi Nagano開發的，他成功將傳統Hi-C的基礎步驟應用到了單細胞中。研究人員在單個細胞的細胞核中交聯染色質以保持環的形態，用酶消化掉非交聯的染色質，然后連接自由末端并進行測序，在。（延伸閱讀：Nature揭示染色體真實面貌）
進行這樣的微量操作，需要我們在細節處理上一絲不茍。據Laue介紹，目前只有Nagano總能獲得一致性的實驗結果。此外，測序后的計算分析也是這個方法的關鍵所在，因為DNA擴增會帶來許多噪音信號。
揭露組蛋白上的修飾
細胞中的表觀遺傳學改變也發生在組蛋白水平上，比如甲基化、乙酰化和磷酸化。現在人們已經找到了在單細胞中成像組蛋白修飾的方法。美國弗吉尼亞大學的Delphine Gomez和Gary Owens合作，通過熒光探針和原位雜交分析了平滑肌細胞里的組蛋白修飾。他們對鄰位連接檢測進行了改良，利用二抗點亮存在表觀遺傳學修飾的組蛋白。雖然這一方法只能用于固定了的組織，但在不同發育階段對細胞進行檢測，可以揭示隨著時間推移而發生的改變。（原文連接：Nat Methods, 10:171-77, 2013,）
如果你需要檢測活組織中的組蛋白表觀遺傳學修飾，你可以參考Kazuki Sasaki等人開發的檢測技術。這個RIKEN團隊在熒光共振能量轉移FRET的基礎上構建了新型感應器，以監控特定組蛋白殘基上的乙酰化。他們開發的探針稱為Histac，主要適用兩種熒光蛋白夾著一個組蛋白和一個能識別組蛋白乙酰化的溴區結構域(Bromodomain)。當乙酰化不存在時，Histac感應器會生成很強的熒光信號。當組蛋白被乙酰化的時候，構象改變會拉開兩個FRET元件的距離，生成較弱的熒光信號。研究人員用這個技術觀察了有絲分裂過程中的組蛋白乙酰化改變。不過Sasaki等人提醒道，目前這種探針需要向細胞中引入外源組蛋白，有改變細胞基因表達的可能。未來的新一代的Histac探針將會避免這一問題。
前景展望
對于前文提到的單細胞表觀遺學研究方法而言，污染問題都是重中之重，因為這類實驗的樣本和試劑量都很小。如果你的DNA樣本很多，那么擴增步驟通常能蓋過污染。但對于單細胞研究來說，“整個流程的每一步都有可能引入污染，破壞掉真實的信息，”Kelsey說。“我們可以參照二三十年前做PCR時的那些注意事項。”
研究者們普遍認為，單細胞表觀遺傳學領域的下一步發展，是將多種研究方法的結合起來使用。在未來幾個月或者幾年里，我們將會看到能在單個細胞中同時檢測轉錄組和表觀基因組的技術。深入了解更多的單細胞信息，可以幫助人們理解不同細胞之間的差異，以及這些差異對發育或疾病狀態所產生的影響。
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