脂氧合酶（Lipoxygenase, LOX）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū) 分光光度法 50 管/24 樣 注意：正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。 測(cè)定意義： LOX 廣泛存在于動(dòng)植物組織中，催化不飽和脂肪酸氧化反應(yīng)，導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化。在生物體 的生長(zhǎng)發(fā)育、成熟衰老及逆境脅迫過(guò)程中具有重要作用。 測(cè)定原理： LOX 催化亞油酸氧化，氧化產(chǎn)物在 280nm 處有特征吸收峰；測(cè)定 280nm 吸光度增加速率， 來(lái)計(jì)算 LOX 活性。 自備儀器和用品： 研缽、冰、臺(tái)式離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、1mL 石英比色皿、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。 試劑組成和配制： 試劑一：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。 試劑二：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。 試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存。 粗酶液提取： 按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。16000g，4℃離心 20min，取上清置冰上待測(cè)。 測(cè)定： 1. 分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 280nm，蒸餾水調(diào)零。 2. 在試劑三中加入 25mL 試劑二（振蕩混勻 1min），在 30℃水浴中預(yù)熱 10 min 以上。用不 完的試劑 4℃保存。 3. 對(duì)照管：依次在 1mL 石英比色皿中加入 100μL 樣本和 900μL 試劑二，30℃反應(yīng) 30min 后，記錄 A 對(duì)照。 4. 測(cè)定管：依次在 1mL 石英比色皿中加入 100μL 樣本和 900μL 試劑三，30℃反應(yīng) 30min 后，記錄 A 測(cè)定。 5. ΔA=A 測(cè)定-A 對(duì)照 LOX 活性計(jì)算公式： （1）按照蛋白濃度計(jì)算 活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘催化吸光值變化 0.01 個(gè)單位為 1 個(gè)酶活單位。 LOX (U/mg prot) =ΔA×V 反總÷(Cpr×V 樣)÷T×100 = 33.33×ΔA÷Cpr （2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算 活性單位定義：25℃中每克組織每分鐘催化吸光值變化 0.01 個(gè)單位為 1 個(gè)酶活單位。 LOX (U/g 鮮重) =ΔA×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T×100 = 33.33×ΔA÷W Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL，需另外測(cè)定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒； V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，100μL=0.1mL；V 反總：反應(yīng)總體積，1mL；V 樣總： 上清液總體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，30min。 |
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