抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP) 染液 生化試劑
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抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP) 染液,在酸性的緩沖液中,細胞內酸性磷酸酶催化底物水解,其生成物進而與一種穩定的重氮鹽偶聯,生成不溶性的偶氮染料沉淀,當底物中存在酒石酸時,該反應只出現在特異性細胞中。
抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP) 染液
(Tartrate-Resistant Acid Phosphate stain)
[檢驗原理]
在酸性的緩沖液中,細胞內酸性磷酸酶催化底物水解,其生成物進而與一種穩定的重氮鹽偶聯,生成不溶性的偶氮染料沉淀,當底物中存在酒石酸時,該反應只出現在特異性細胞中。
[儲存條件及有效期]
本試劑盒室溫密封保存,有效期3 個月。所有應用液配置后要立即使用,當天一次用完。
[所需儀器]
光學顯微鏡、染缸、玻片、滴管、秒表、記號筆等。
O具體試劑配制及操作
一、固定液:液體,40mlx1 瓶
新鮮血涂片、細胞涂片或爬片、冰凍切片用固定液固定 5~10min。石蠟包埋的切片經脫臘后不需要再固定。
二、底物反應液(一) 、(二) 、(三) 、(四) 的組成及配制:
底物反應液(一) 組成及配制
組成:(1) A粉x1 支(2) B 液500ulx1 支(3) C粉x1 支(4) D 液500ulx1 支
配制: 臨用前將 B 液用移液器吸入 A 粉中充分解配成甲液,備用再將 D 液移液器吸入 C粉中充分溶解配成乙液,備用最后將甲液與乙液混合成底物反應(一),備用
底物反應液(二) 組成及配制:
組成:(1) E粉x1支(2) F 液 500ulx1 支
配制: 臨用前將底物反應液二的 F 液移液器吸入 E 粉中充分溶解配成底物反應液(二),備用。
底物反應液(三): G液 lx1 支,備用
底物反應液(四) 組成及配制:
組成:(1) H粉x1 支(2) I液 500ulx1 支
配制: 臨用前將 I液移液器吸入 H粉中充分溶解配成底物反應液四,備用。
底物孵育液的配制:
染色缸染色孵育法:
1. 將底物反應液(一)、(二)、(三)、(四)的備用液混合并充分混勻,
2. 先在染缸內加 30 ml蒸餾水,37℃水浴 10 分鐘,
3. 將底物反應液(一)、(二)、(三)、(四)依次加入已預溫的蒸餾水中,
4. 然后將樣本玻片固定,水洗后還末干前,,立即將樣本玻片放入已準備好的反應孵育液中,避光孵育 60 分鐘。
三、復染液:蘇木素液,10mlx1 瓶甲基綠液,10mlx1 瓶
孵育完后,取出水洗 1 分鐘,在玻片尚未干之前進行復染??捎锰K木素復染 1-2 分鐘,或用甲基綠復染 2~3 分鐘,兩者取其一。
[樣本染色前處理及染色]
O 血涂片及骨髓涂片
1、推片: 取全血或骨髓3 微升左右置載玻片上,將推玻片保持與載玻片 30 度角,置于血滴正前方,稍往后移與血滴接觸,血滴沿推片下緣散開,再勻速沿載玻片平面平穩向前滑動,至血液鋪完血膜為止。滿意效果為不太薄,以免細胞太少,也不要太厚,以免太重疊。
2、涼干:使涂片在空氣中自然涼干,再放入本試劑盒中的固定液內固定 2~3 分鐘, 水洗約30-60 秒
3、一定注意水洗后不要太干時放入底物液中孵育 60 分仲 (太干后染色效果欠佳)
O石蠟切片
1、二甲苯中脫蠟 5-10 分鐘。再換用新鮮的二甲苯,脫蠟 5-10 分鐘
2、無水乙醇5 分鐘。再 90%、70%乙醇各2 分鐘。
3、水合:蒸餾水2 分鐘
O 冰凍切片
1、回溫: 將預先制作好的并保存在-20℃冰箱中的冰凍切片放置到切片架上回溫 約 5-10 分鐘。
注]:
① 可放到37C孵箱中進行回溫;
② 在 37℃水浴箱中放置一個小盒子,再將從冰箱中取出的切片架放到小盒當中,目的是讓冰凍切片回溫到 37℃
2、水合:將回溫好的切片,水中浸泡 1~2 分鐘
[染色結果]
陽性反應為鮮紅色或深紅色顆粒,定位胞漿。
抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP) 染液